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Elisa Method

ELISA

Definition

Im Gebiet der Immunoassays dient ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) dem Nachweis und gegebenenfalls der Konzentrationsbestimmung von Proteinen und Viren oder auch niedermolekularen Verbindungen wie Hormonen, Pestiziden und Toxinen in einer Probe.

Charakteristisch für Enzyme Imunoassays (EIA) ist dabei die Trennung von Proben (Analyt: Antikörper oder Antigene), die von spezifischen Antikörper gebunden werden können, die auf einer festen Oberfläche wie zum Beispiel einer Polystyrol Multiwell Platte immobilisiert sind.

Prinzip

Grundlage für einen erfolgreichen ELISA Test ist die spezifische Bindung des Epitops, einer Aminosäuresequenz auf dem Antigen und dem passenden Antikörper. Letztere können sowohl monoklonaler-, als  auch polyklonaler Herkunft sein. Monoklonale Antikörper stammen aus so genannten Hybridoma-Zellen und binden ein ganz spezifischen Epitop, während polyklonale Antikörper unterschiedlicher Epitope eines Antigens binden und tatsächliche eine Mischung von verschiedenen Antikörpern, die aus einem Tierserum auf gereinigt wurden, darstellen. Bevorzugt werden polyklonale Antikörper in der sekundären Detektion des Analyts in indirekten ELISA Tests verwendet. Monoklonale Antikörper werden aufgrund ihrer Spezifität gegenüber einem ganz bestimmten Epitop auf dem zu untersuchenden Analyt vor allem für die primäre  Detektion und  Bindung des Antigens benutzt. Die Konzentration des Analyts kann schlussendlich mittels eine Farbreaktion ermittelt werden und quantitativ ausgewertet werden. Durch ihre einfache Handhabung und Schnelligkeit haben sie die Radioimmunassays ersetzt.

Zunächst wird für die erfolgreiche Durchführung eines ELISA Test ein dünner Film eines spezifischen Antikörpers oder eines Antigens auf einer Polystyrol Multiwell Platte befestigt. Nach einem Blocking-Schritt, in dem noch ungebunden Stellen auf der Platte abgedeckt werden, folgt die Detektion des Analytes mittels eines Enzym-konjugierten Antikörper oder Antigens, dass spezifisch an diese dünne Beschichtung bindet.  Um nun ein Signal zur Messung  der gebundenen Analyte zu erhalten, wird ein Substrat hinzugegeben, das, indem es mit dem am Antikörper oder Antigen konjugierten Enzym reagiert, zu einem Farbumschlag führt. Während der Durchführung eines solchen ELISA Test sind die Waschschritte zwischen den Vorgängen für eine optimale Signalausbeutung besonders wichtig.

ELISA - Typen

Zusätzlich kann zwischen vier ELISA Test Formaten unterschieden werden: direkter ELISA Test, indirekter ELISA Test, Sandwich ELISA Test und kompetitive oder inhibitorische ELISA Tests.

Im Falle des direkten ELISA Tests wird mittels eines direkt an ein Enzym konjugierten Antikörpers das entsprechende Antigen beziehungsweise der Analyt detektiert. Weniger weit verbreitet, aber trotzdem verwendbar ist das genaue Gegenteil: Der spezifische Antikörper ist an der Multiwell Platte befestigt und ein markiertes Antigen wird für die Detektion benutzt. Vorteile des direkten ELISA Test sind seine Schnelligkeit und geringere Fehleranfälligkeit, da Anzahl der Schritte und verwendeten Reagenzien im Gegensatz zu den folgenden Möglichkeiten reduziert sind.

Das Format des indirekten ELISA Tests nutzt zunächst einen unmarkierten primären Antikörper, der spezifisch an das zu detektierende Antigen bindet. Dieser wird im zweiten Schritt durch einen polyklonalen Enzym-konjugierten sekundären Antikörper gebunden, der gegen eine bestimmte Spezies (z.B. anti-Maus) gerichtet ist. Zu den Vorteilen des indirekten ELISA Tests gehören dessen erhöhte Sensitivität, Flexibilität und geringere Kosten, aufgrund der reduzierten Anzahl an konjugierten Antikörpern.

Beim Sandwich ELISA Test binden zwei Antikörper an zwei verschiedene, nicht überlappende Epitope des Analyts, sodass das Analyt wie in einem Sandwich von beiden Seiten gebunden wird. Dafür wird die Polystyrol Platte mit dem ersten Antiköper („Capture Antibody“) beschichtet. Nachdem die Probe mit dem zu detektierenden Analyt hinzugegeben wurde, folgt die Inkubation mit dem sekundären Antikörper („Detection Antibody“), um die Konzentration des vorliegenden Analyts messen zu können. Hierbei kann erneut zwischen direktem Sandwich ELISA, bei dem der „Detection Antibody“ mit einem Enzym konjugiert ist und dem indirekten Sandwich ELISA, dessen „Detection Antibody“ unkonjugiert ist, unterschieden werden. Letztere Methode bedarf dann allerdings eines zusätzlichen konjugierten, sekundären Antikörpers für die Messung. Ebenso wie beim indirekten ELISA sind die Vorteile des Sandwich ELISA Tests dessen Flexibilität und Sensitivität. Zusätzlich ist es auch möglich, komplexe Proben ohne vorhergehende Aufreinigungsschritte, spezifisch zu detektieren.

Kompetitive ELISA Tests (auch als Inhibitive ELISA Tests bezeichnet) detektieren die Konzentration des Analytes (Antikörper oder Antigen) in der zu untersuchenden Probe, indem sie das zu erwartende Signal beeinflussen beziehungsweise stören. Verwendung findet diese Methode oft, wenn lediglich ein Antikörper für das spezifische Antigen verfügbar ist oder der zu bindende Analyt zu klein ist, um von zwei verschiedenen Antikörper gebunden zu werden. Als Grundlage wird dabei zwischen den drei zuvor beschriebenen ELISA Test Formaten gewählt. Im Falle des direkten ELISA Test Formats würden das Antigen mit dem beschichteten Antigen der Multiwell Platte, wenn diese übereinstimmen, um die Bindung an den „Detection Antibody“ konkurrieren (Competion: engl. Für Konkurrenz, Wettkampf). So würde im Falle einer hohen Konzentration des Antigens in der Probe das Signal des Assays erheblich reduziert werden, da im Waschschritt der Komplex aus Proben-Antigen und „Detection Antibody“ aus dem Assay entfernt werden würde. Auch hier kann je nach Konjugation des „Detection Antibodies“ zwischen direkt und indirekt unterteilt werden.

Weit verbreitet sind im Falle der direkten Detektion die alkalische Phosphatase (AP) und die Meerrettich Peroxidase (HRP), die beide zu einem kolorimetrisch messbaren Farbumschlag führen. Neben dieser Analyse durch ein Spektrofotometer kann die Wahl allerdings auch auf Fluoreszenz-markierte Antikörper fallen. Für die indirekte Detektion wird meist ein Biotin-konjugierter Antikörper genutzt, auf dessen Analyt-Bindung eine Streptavidin-konjugierte Enzymreaktion folgt.

Auswertung des ELISA

Durch den Vergleich des Signals des Assays mit einer Standardkurve kann das gemessene Ergebnis anschließend quantitativ ausgewertet werden und die vorliegende Konzentration des Antigens präzise bestimmt werden. Auch die qualitative, also ob ein bestimmtes Antigen in der Probe vorhanden ist, kann untersucht werden. Die graphische Darstellung der ELISA Daten erfolgt durch die Auftragung der optischen Dichte gegen den Logarithmus der Konzentration, sodass die entstehende Kurve eine sigmoidale Form aufweist. Durch den Vergleich mit dem linearen Teil dieser sigmoidalen Standardkurve, entweder manuell oder durch die Software, die durch den ELISA Platten Reader mitgeliefert wurde, kann die Konzentration der zu untersuchenden Probe abgelesen werden.

Entdecke die Vielfalt unserer ELISA - Kits

Neben den zuvor beschriebenen Formaten bieten wir dir für deine Auswertung Kolorimetrie, sowie Chemielumineszenz und auch bei der Wahl eines Probentypes ist die Bandbreite sehr vielfältig (von z.B. Serum, Plasma, Körperflüssigkeiten wie Urin, Zellkultur-Überstände bis hin zu Zell- und Gewebelysaten). Nutze bei deiner Suche nach einem passenden ELISA Kit die Filtermöglichkeiten am linken Rand der Webseite, um deine Suche auf bestimmten Spezifitäten, Hersteller, Applikationen, Ursprungsspezien und Isotypen einzuschränken. Falls du die weitergehende Informationen benötigst, dann kannst du gerne unseren Kundenservice nutzen, der dir per Chat, Email oder Telefon zur Verfügung steht.