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ELISpots

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Die Sezernierung von Antikörpern und Zytokinen nach der Antigen-Stimulation einer Immunzelle kann mittels des ELISpot Assays (Enzyme Linked Immuno Spot Assay) nachgewiesen werden. Diese Technik ist daher essentiell für die Untersuchung der zellulären Immunantwort. Dabei zeichnet sie sich besonders durch ihre Sensitivität und die Möglichkeit aus, seltene Antigen-spezifische Zellen zu visualisieren. Die Detektion einzelner Zellen erfolgt dabei aus einer Population von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (engl.: Peripheral Blood Mononuclear Cell, kurz PBMC).

Für einen ELI-Spot, der eine Abwandlung des Sandwich ELISAs darstellt,  wird eine undurchsichtige Membran (meistens aus PVDF) auf einer 96-Well Mikrotiterplatte mit dem Erstantikörper (mono- oder polyklonal) beschichtet. Es folgt die Zugabe der Zytokin- oder Antikörper-sezernierenden Immunzellen zusammen mit einem Stimulus (z.B. Antigen oder Peptid). Die Epitope der, von den stimulierten Immunzellen sezernierten, Proteine werden daraufhin von den immobilisierten Fängerantikörpern (engl. capture antibody) selektiv gebunden. Sterile FCS- oder BSA-Lösungen werden zur Blockierung von unspezifischen Proteinbindungsstellen der Membranen eingesetzt.

Ziel des ELI-Spots ist die Bindung der immobilisierten Antikörper an ein spezifisches Epitop, auf den sezernierten Zytokinen oder Antikörpern. Es folgt die Inkubation in einem humiden CO2 Inkubator, die Zellentnahme und letztlich die Detektion mit einem Detektionsantikörper. Für die direkte Detektion sind diese Antikörper meist mit der alkalischen Phosphatase (AP) oder der Meerrettich Peroxidase (HRP) konjugiert, die einen kolorimetrisch messbaren Farbumschlag zur Folge haben. Aber auch die Verwendung von Fluoreszenz-markierten Antikörpern ist möglich. Für die indirekte Detektion wird meist ein Biotin-konjugierter Antikörper genutzt, auf dessen Analyt-Bindung eine Streptavidin-konjugierte Enzymreaktion folgt. Einzelne reaktive Zellen werden dabei durch einen Punkt (ImmunoSpot) markiert. Problematisch kann hierbei allerdings eine nicht erschütterungsfreie Inkubationsdauer sein: Die tatsächliche Anzahl an Spots kann, bedingt durch die laterale Bewegung von nicht-adhärenten Zellen (Suspensionszellen) bei einer Erschütterung niedriger sein, als die zu beobachtende Spot-Anzahl.

Die Auswertung eines ELI-Spot Assays kann entsprechend der sekretierten Zytokine oder Antikörper, also qualitativ, oder entsprechend der Anzahl der markierten Zellen, also quantitativ, erfolgen. Dies kann sowohl manuell, als auch unter Verwendung eines passenden Lesegeräts geschehen.